Введение
Как размножаются растения? Известны половой, бесполый и вегетативный способы размножения. Половой – это получение семян, бесполый – размножение за счёт спор (свойственно водорослям и папоротникам) и наконец вегетативный, когда часть растения может стать самостоятельным организмом. Такой способ позволяет получать генетически однородные растения.

Суть МКР

Микроклональное размножение растений (МКР) основано именно на вегетативном способе, со значительными отличиями.

Первое и самое главное – размер, при вегетативном способе необходимо, что бы отделённая часть могла самостоятельно обеспечивать свою жизнедеятельность до тех пор, пока не сформируются все органы (корни, листья и т.д) необходимые для полноценного существования. Микроклональное размножение подразумевает использование лишь небольшого фрагмента растения (самое экстремальное 2-е клетки). Такой кусочек самостоятельно выжить не способен, и его жизнь поддерживается идеальными условиями, созданными для него.

Второе отличие вытекает из первого. Так как размер отличается, отличается и количество новых растений полученных из исходного. При обычном вегетативном размножении из одного организма можно получить, в лучшем случае несколько десятков. При микроклональном размножении количество копий исходного растения не ограничено.

Третьим значимым различием является сложность процесса. При классическом вегетативном размножении достаточно поместить черенок в воду, подождать появления корней и посадить в почву. Клональное размножение подразумевает многоэтапный процесс (стерилизация, фрагментированные, калусогенез, укоренение, рост, акклиматизация и т.д).

Четвертым стоит отметить разницу в качестве поученных копий, при микроклональном размножение посадочный материал получается свободным от заболеваний (бактериальные, вирусные и т.п.). Это одно из важнейших отличий, способствующее активному развитию микроклонального размножения (МКР).

Теория

Ну а теперь, для тех, кто дочитал до этой главы, поглубже разберём теорию.

Термины
Каллус - называют дедифференцированные (потерявшие специализацию) клетки, являющиеся тотипотентными.

Тотипотентность - способность клетки путём деления дать начало любому клеточному типу организма.

Меристема - ткани растений, состоящие из интенсивно делящихся и сохраняющих физиологическую активность на протяжении всей жизни клеток. Эти клетки обеспечивают непрерывное нарастание массы растения и предоставляют материал для образования различных специализированных тканей.

Гормоны (фитогормоны) - низкомолекулярные органические вещества, вырабатываемые растениями и имеющие регуляторные функции. Действуют в очень низких концентрациях, вызывая различные физиологические и морфологические изменения в растениях.

Питательная среда – жидкая или гелеобразная субстанция обеспечивающая жизнедеятельность эксплантов.

Эксплант - группа клеток, отделенная от материнского организма.

Этапы клонального размножения
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:

1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.

3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям.

4. Использование полученных растений по назначению (продажа, высадка, проведение экспериментов и т.д.)

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

1 этап
Для начал необходимо определится с растением донором. Обычно выбирают какое-то отличившееся растение (имеет больше урожая, обильнее цветение, необычный цвет строение и т.д). Дальше с него, в зависимости от технологии, отделяют определённые части. Чаще всего это меристемы, однако в некоторых способах размножения можно использовать любые клетки, но об этом позже.

Отделённые экспланты имеют микробиологическое загрязнение, которое будет пагубно влияет на процесс, поэтому необходима стерилизация. Эксплант обрабатывают специальным раствором, который уничтожает бактерий и грибки, вирусы же, при использовании меристем, обычно отсутствуют в них. Для стерилизации обычно используются различные химические реагенты: этиловый спирт, диацид, меркурий хлорид, мыльный раствор, раствор белизны.

После обработки экспланты помещают в специальную среду, где они растут, формируя новые меристемы для дальнейшего размножения. Сейчас гормональный баланс сред нацелен на развитие вегетативных органов.

2 этап
По сути, этот этап не отличается от первого, разве, что теперь экспалнты значительно мельче, это буквально одиночные верхушечные почки, которые так же помещаются в специальную среду, где они растут, формируя побеги, но пока без корней. Достигая определённых размеров, клоны переходят на следующий этап.

3 этап
Окрепшие и подросшие черенки необходимо укоренить, ведь сейчас корней либо вообще нет, либо они присутствуют в плохо развитом состоянии. Для этого достаточно поменять среду культивирования, в которой гормональный состав стимулирует именно корнеобразование.

После появления корней клоны сажают в грунт или другой субстрат, в котором планируется дальнейшее выращивание. Сейчас растения ещё очень хрупкие, они привыкли расти в стерильной среде, да вокруг была повышенная влажность, если их сразу пустить на свободу они, с большой вероятностью, погибнут. Требуется процесс адаптации. Постепенно меняют влажность воздуха, освещённость и температурный режим, так до тех пор, пока растения не будут полностью готовы к самостоятельному выживанию. За это время клоны так же встречаются с окружающей микрофлорой, к которой так же необходимо привыкнуть.

4 этап описывать смысла нет, тут всё и так понятно, полученные растения реализуются или направляются по назначению.

Питательная среда

Самые главные достижение науки, позволившее освоить МКР – понимание потребностей питания растений и изучение этапов развития растений в целом и на клеточном уровне. По минеральному питанию: требуется такие вещества как азот, фосфор, калий, кальций, магний, железо, сера и ещё с десяток микроэлементов.

Для жизнедеятельности необходимы химические источники энергии, обычно растения производят их в процессе фотосинтеза, но экспланты полноценными растениями не являются, поэтому в среду добавляют сахара. По той же причине, в среде необходимо присутствие определённых витаминов потому, что самостоятельный синтез пока не налажен в черенках.

Обычно растения самостоятельно регулируют гормональный фон в различных органах, заставляя ткани развиваться определенным образом, но для МКР требуется направить ресурсы эксплантат в определённое русло. В основном регулируется развитие растения в среде при помощи ауксинов и цитокинов.


Среда бывает как жидкая, так и полутвёрдая. В жидкой среде обычно культивируются клеточные культуры, но она не удобна для закрепления маленьких эксплантов, тут подходят агаризированные среды, свое рода холодец. В такой среде прекрасно закрепляются меристемы. Для придания питательной среде требуемой консистенции чаще всего используют агар-агар.

Экспланту свойственно выделять в питательную среду токсичные веществ (фенолы, терпены и другие вторичные соединения). Для борьбы с этими веществами используют антиоксиданты. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую кислоту, глютатион, дитиотриэтол, диэтилдитиокарбомат, поливинилпирролидон.


Мы рассмотрели лишь основные классы веществ, но встречаются и спецефичные добавки. Подбор концентраций компонентов зависит от культуры и типа самого экспланта. Наиболее популярный рецепт питательной среды был разработан физиологами растений Тошио Мурасиге и Фольке К. Скугом в 1962 году (среда МС). Она универсальна, хотя и требует некоторых корректировок под различные культуры.

Вот её состав:


Готовиться такая среда в несколько этапов. Сначала готовят маточные растворы с высокой концентрацией, которые в дальнейшем добавляют в общую смесь. В среду МС в первую очередь вносят минеральные вещества и сахара, потом раствор подвергают стерилизации (автоклавирование или фильтрация) и уже потом добавляют чувствительные к высокой температуре вещества (витамины и гормоны). Затем ещё теплая разливается по посуде, где после застывания становится пригодной.

Способы МКР
-активация развития уже существующих в растении меристем

-индукция образования адвентивных почек непосредственно на тканях экспланта

-индукция соматического эмбриогенеза

-дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях

Путь МКР
Разбор каждого способа очень объёмен, а эта статья и так уже сильно растянулась, так что вкратце стоит сказать: способы несколько отличаются растворами, подготовкой эксплантов и конечным результатом. К примеру, когда происходит каллусогенез, но на экспланте нет частей взрослого растения, могут произойти различные сбои в развитии и даже мутации. В итоге полученный клон хоть и будет генетически идентичен, но развиваться будет совершенно по-другому.

Заключение

Микроклональное размножение (МКР) является прогрессивным способом получения посадочного материала. МКР имеет следующие преимущества:

- получение генетически однородного посадочного материала;

- освобождение растений от вирусов за счёт использования меристемной культуры;

- высокий коэффициент размножения (10⁵—10⁶ — для травянистых растений, 10⁴—10⁵ — для кустарников, 10⁴ — для хвойных растений);

- сокращение продолжительности селекционного процесса;

- ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

- размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

- возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала.

Несмотря на все плюсы, как и любая технология, МКР имеет и свои недостатки:

- трудоемкость технологии, сложный технологический цикл;

- высокие требования к квалификации персонала;

- высокая стоимость оборудования;

- трудоемкость адаптации клонов к естественным условиям выращивания.

В целом, при должном желании, освоить МКР способен каждый и не обязательно для это иметь лабораторию с большим штатом, главное запастись терпением и соответствующей литературой.
#микроклональноеразмножение #клонирование #растения #наука