Родился будущий святитель в 1623 году в селе Антилохово Владимирской губернии в благочестивой семье иерея Василия и его супруги Марии. Мальчика родители назвали Михаилом в честь святого Архистратига Михаила. Отец его был сельским священником. При храме родителя и провел Михаил свое детство и отрочество.

Затем он женился и принял священный сан по примеру отца. Прослужил он в иерейском чине до 40 лет, пока не скончалась его супруга.

В 1663 году отец Михаил овдовел и поселился сначала в Николо-Шартомском монастыре, затем в Свято-Успенской Золотниковской пустыни, известной обители того времени. Там он принял монашеский постриг с именем Митрофан в честь святого Митрофана Константинопольского. В полюбившейся ему обители новопостриженный предался монашескому подвигу, смиренно исполняя послушания, строго постясь и ревностно молясь. Пробыл он там всего три года.

Братия Яхромского Козминского монастыря на тот момент лишилась своего игумена и ходатайствовала перед начальством о назначении отца Митрофана их духовным отцом и руководителем. Покорно принял будущий святитель это назначение как волю Божию о себе. Будучи посвящен в сан игумена обители, он правил ею в духе благочестия в течение десяти лет.

В 1675 году Святейший Патриарх Иоаким, знавший отца Митрофана как благоговейного и благодетельного служителя Божия, назначил его игуменом другого, Макарьевского Желтоводского монастыря, рукоположив в сан архимандрита. В то время монастырь был знаменит и находился под покровительством дома Романовых. При настоятельстве архимандрита Макария в обители был построен новый храм, щедро украшенный утварью и иконами. Особенно почитал настоятель преподобного Макария Желтоводского, чьи мощи покоились в обители. В конце своей жизни он принял великую схиму с именем Макарий в честь этого святого.

2 апреля 1682 года, архимандрит Митрофан принимает хиротонию во епископа Воронежского. Это произошло по желанию царя Феодора, который благоволил пастырю. Кафедра была новая, открытая по большей части для борьбы с распространившимся старообрядчеством, при этом бедная. На земле Воронежской в то время было немирно из-за «беспоповцев», невольных поселенцев из других мест, местного народа, не отличавшегося высокими нравами. Задача по наведению порядка в епархии перед святителем стояла серьезная.

Прибыв на кафедру, святитель первым делом разослал священнической братии послание, в котором говорилось: «Честные иереи Бога Вышнего! Вожди стада Христова! Вы должны иметь, светлые умные очи, просвещенные светом разумения, чтобы вести других по правому пути. По слову Господа, вы должны быть самым светом: «Вы есте свет миру» (Мф. 5: 14)… Христос Спаситель, когда вручал святому апостолу Петру пасение овец Своих, трижды говорил ему: «Паси овец Моих» (Ин. 21: 15). Это, очевидно, для того, что пастыри трояко пасут врученное им стадо: словом учения, молитвою и силой Святых Таинств, наконец, образом жизни. Эти три вида спасения и вы усердно выполняйте: преподавайте людям слово учения, показывайте на себе пример доброй жизни, усердно возносите молитвы к Богу о врученной вам пастве, укрепляя их Святыми Тайнами; наипаче же неверных просвещайте святым Крещением, и согрешивших приводите к покаянию. Будьте внимательны к болящим, чтобы не отошли от сей жизни без причащения Святых Тайн и помазания святым елеем». Из этого послания видно, каким милостивым к пастве и ревностным к служению был святитель Митрофан. Неустанно своим примером он наставлял верующих в верности учению Единой Святой Апостольской Церкви.

Радея о нравственно-религиозном состоянии своей паствы, святитель большое внимание уделял тому, чтобы люди жили в целомудрии, заключали христианский брак по всем правилам, так как были распространены незаконные браки. Священников и храмов в обширной епархии катастрофически не хватало. При скудости епархиальных средств святитель, однако, построил множество новых церквей, в том числе пятиглавый кафедральный собор Воронежа в честь Благовещения Пресвятой Богородицы. В этом богоугодном деле ему помогала семья Романовых. Собор вышел великолепно благоукрашенным. При святителе Митрофане в епархии было открыто два новых монастыря. О дисциплине монашествующих архиерей Воронежский также имел особое попечение, так как до него монашество в этой местности находилось в упадке. При нём была устроена женская обитель в Ельце, заведены строгие уставные порядки.

Установились отношения у святителя и с царем Петром I. Последний в 90-х годах XVII века начал строить в Воронеже корабельную верфь для похода на Азов. Епархиальные средства шли на помощь царю в этом деле, за что святителю был дан титул Азовский, измененный позже на Воронежский и Елецкий. Царь с почтением относился к архиерею, и тот до самой своей кончины пользовался царским расположением. Епископ Воронежский также поддержал Петра I в идее основать столицу на берегах Невы. Он благословил царя Казанской иконой Божией Матери со словами: «Она станет покровом для новой столицы и всего народа твоего. Вражеская нога не ступит в город, пока там будет эта икона». Впоследствии в Санкт-Петербурге был построен Казанский собор, а святителя Митрофана негласно считают крестным отцом Санкт-Петербурга.

В течение двадцати лет служил святитель Митрофан на Воронежской кафедре. Сам он жил очень нестяжательно и просто. Питался и одевался скромно. После его кончины не осталось даже его личных денег для погребения. В своем «Духовном завещании» он писал: «А келейных денег у меня нет… не имам в келии своей ни злата, ни сребра, что дати на воспоминание души моей грешной». Как настоящий монах, всегда держал он в уме память смертную.

В августе 1703 года святитель почувствовал скорую кончину и принял великую схиму с именем Макарий. Скончался в ноябре того же года. Царь Петр I сам нёс гроб с телом своего наставника со словами: «Не осталось у меня более такого святого старца. Буди ему вечная память».

В 1831 году мощи святителя Митрофана были обретены нетленными. На следующий год было совершено прославление епископа Воронежского в лике святых. Его мощи хранились в соборе в кипарисовой раке. Там же находилась и его мантия, которую прикладывали к недужным, и те получали исцеления.

В советское время монастырь был закрыт и разграблен. В 1919 году произошло кощунственное вскрытие мощей святителя советской властью с целью «покончить с поповскими баснями о святых мощах». Братия монастыря и богомольцы плакали, наблюдая происходящее, не в силах этому помешать. Безбожники совершили опись мощей, определив их в «социалистическую собственность».

С 1929 года святые мощи святителя Митрофана несколько десятилетий хранились в Воронежском краеведческом музее. Лишь в 1989 году они были возвращены Церкви, ныне же покоятся в Воронежском Благовещенском кафедральном соборе.