Храм строили с 1652 по 1687 год. Он был возведён на месте обветшавшего деревянного храма во имя Бориса и Глеба, по которому и называлась слобода. Первый храм на этом месте появился предположительно в 1238 году. В 1652 году была выстроена каменная шатровая с трапезной и двумя приделами церковь, которая была освящена 24 июля 1652 года.

Одна из наиболее почитаемых икон собора — огромный трехметровый поясной образ Спаса Всемилостивого (298 × 276 см). Лик Спасителя на ней занимает основную часть иконы, а благословляющая рука и Евангелие оказываются непропорциональны ему — возможно, изначально иконописец планировал изобразить «Спас Оплечный». В летнем храме икона располагается у северо-западного столба, ближе к северной стене. При переносе в зимний храм икону располагают в юго-восточном углу помещения.

Есть несколько версий происхождения этой иконы. Все популярные легенды, так или иначе, относят икону к XIV—XV векам. По одному из преданий, она была написана Дионисием Глушицким в начале XV века. Также существует легенда, что икону принесла река Волга, и волны прибили её к берегу у Борисоглебска. Третья версия рассказывает о даре некоего князя, в котором искусствовед, краевед и историк Юрий Шамурин видел впоследствии канонизированного в лике благоверных угличкого князя Романа Владимировича, который был основателем города Романова во 2-й половине XIII века. Этому князю икона «Спас Борисоглебский» была дарована «монахами из заморского края». Также среди современного населения Тутаева существует версия, что икона была частью деревянных небес старого храма, а впоследствии была вставлена в раму.