Внутреннее убранство собора включает более 100 росписей и 52 живописных полотна. Западная часть здания посвящена сюжетам Ветхого Завета — от Сотворения мира до пророчеств. Восточная — Евангельским событиям, раскрывающим земную жизнь и Страсти Христовы.

Однако подлинным центром смыслового и художественного притяжения является купол собора. Его роспись охватывает площадь 816 квадратных метров. В центре композиции — образ Богоматери в молитве, в окружении святого Иоанна Крестителя и Иоанна Богослова. Эта сцена изображает ходатайство Пресвятой Девы за человеческий род.Автор этой монументальной работы — великий Карл Брюллов, которому заказ поступил дважды. В первый раз он отказался от исполнения, не желая идти на компромиссы с требованиями архитектора Огюста Монферрана. Однако усилиями влиятельных покровителей — великой княгини Елены Павловны, композитора Алексея Львова и графа Михаила Виельгорского — Брюллову удалось вернуть заказ и приступить к росписи.

Работа оказалась крайне трудной: не только из-за художественных задач, но и по причине тяжелых условий — здание ещё достраивалось, в нём царили влажность и холод. Брюллов десятки раз переделывал эскизы — по разным данным, их число достигало 40. Император Николай I отверг 22 варианта композиции. Брюллов стремился создать роспись, способную конкурировать с плафоном Сикстинской капеллы — и эта амбиция чувствуется в каждой детали его творения.

Но завершить работу художнику не суждено — подорвав здоровье, он уехал лечиться в Италию, где и умер в 1852 году, не дожив до 53 лет. Его похоронили в Риме на Некатолическом кладбище. Завершил начатое его друг и коллега по Академии художеств Пётр Басин, написавший фигуры апостолов и фоны купольной композиции.

В самом центре купола парит белый голубь — символ Святого Духа. Скульптура находится на высоте 86,5 метра, её размах крыльев составляет внушительные 2 метра. Изготовлен голубь в 1850 году методом гальванопластики мастером Иваном Дылёвым — выходцем из крестьян Ярославской губернии. Его отец, Тимофей Дылёв, заложил в Петербурге целую династию скульпторов, работавших над оформлением дворцов в Петергофе, Ораниенбауме, Царском Селе и в самом Зимнем дворце.

Исаакиевский голубь — не просто украшение. Он словно замыкает архитектурное и духовное пространство, напоминая о сцене Крещения Христова, когда «Дух Божий снизошёл в виде голубя» (Ин. 1:32). Эта деталь делает роспись купола не только художественным, но и богословским центром собора.

В советское время фигуру голубя демонтировали, а в центре купола установили маятник Фуко. Лишь в 1986 году историческую справедливость частично восстановили: голубя вернули в интерьер и поместили на постамент, где он и поныне остаётся объектом внимания и символом духовного начала.