Лекция №9

Тема: Основы генетики человека.
1. Генетика человека: предмет и задачи.
2. Специфика генетики человека.
3. Методы изучения генетики человека.
1. Генетика человека, или антропогенетика (от греческого «antropos» - человек) изучает явления наследственности и изменчивости, закономерности наследования признаков, их изменения под действием условий окружающей среды.
Изучение реализации генетических механизмов на клеточном, молекулярном, организменном и популяционном уровнях привело к выделению различных разделов генетики человека – популяционной, биохимической, цитогенетики, иммуногенетики, генетики развития, генетики соматических клеток, молекулярной генетики, фармакогенетики, клинической генетики и других.
Помимо этих основных разделов генетики человека, выделяют онкогенетику, определяющую генетические механизмы опухолевого роста клеток, генетику онтогенеза, выявляющую особенности генетического контроля процессов раннего эмбрионального развития. В последние годы в рамках различных медицинских специальностей стали выделять разделы, посвященные изучению наследственных болезней, например, нейрогенетику, изучающую особенности наследования болезней нервной системы, офтальмогенетику, изучающую наследственные заболевания органа зрения и др.
Важнейшей задачей развития генетики человека в течение всего периода существования человечества являлось изучение процессов функционирования организма человека. Достижения в генетике человека обусловлены анализом законов природы и типом наследования мутационных изменений у человека. В настоящее время генетики человека интенсивно развивается и является важнейшей частью теоретической медицины.
Медицинская генетика изучает роль наследственности в патологии, закономерности передачи наследственных болезней, методы диагностики, профилактики и лечения наследственных болезней, а также болезни с наследственной предрасположенностью. Современные достижения медицины и генетики направлены на борьбу с болезнями и улучшение здоровья людей.
Значение генетики человека для медицины огромно. Она как часть теоретического фундамента медицины расширяет и углубляет биологическое мышление медицинского работника. Для медицинского работника знание основных положений наследственности и изменчивости человека необходимо для понимания новых методов диагностики, профилактики и лечения наследственной патологии. Достижения медицинской генетики внедряются во все этапы медицинской помощи. Выявлено, что у человека встречается около 5 000 наследственных болезней обмена веществ. С наследственными и врожденными заболеваниями рождается около 5% детей. На 1 000 родившихся детей у 30-40 обнаруживаются различные нарушения развития. Наследственных нарушений скелета известно около 100 форм. Частота врожденных пороков развития после Чернобылской аварии увеличилась в Белоруссии и Украини на 40%. 10% всех врожденных пороков развития (ВПР) являются следствием хромосомных аберраций.
Примеры ВПР: агенезия – отсутствие органа (например, конечности); гипогенезия – недоразвитие органа (например, гонад); гипергенезия – усиленное развитие органа (например, полидактилия); атрезия – заращение естественных отверстий и каналов (например, пищевода); эктопия - необычное расположение органа (например, сердце с правой стороны) и др. Таким образом, у большинства людей в течение их жизни проявляется хотя бы одно серьезное генетически обусловленное отклонение от нормы, снижающее работоспособность и продолжительность жизни человека. Наиболее важными направлениями в исследованиях генетики человека являются изучение молекулярной природы генетических изменение, анализ их закономерностей наследования, оценка их распространенности в различных популяциях человека, изучение роли мутагенных факторов окружающей среды.
Современная генетики человека характеризуется стремительным прогрессом наших знаний о молекулярном строении генетического материала и механизмах мутагенеза. Примером прогресса в области генетики человека являются успехи реализации международной программы «Геном человека». Использование достижений программы «Геном человека» позволит идентифицировать гены, ответственные за возникновение наследственных заболеваний, а также разработать системы лечения, основанные на введении новой генетической информации, исправляющие генетические дефекты.
Возможность решения насущных проблем генетики человека и медицинской генетики предоставлена благодаря интенсивному накоплению научной информации, применению современных молекулярно-генетических методов исследования, диагностике наследственных заболеваний, профилактических мероприятий этих заболеваний и новых подходов к их лечению.
Медицинский работник должен знать аспекты генетики человека и медицинской генетики для оказания помощи каждой семье иметь здорового ребенка и борьбы с наследственными заболеваниями.
2. Человек, как объект генетических исследований сложен и вместе с тем удобен.
Сложности человека как генетических объект:
1. Невозможность применения гибридологического анализа у человека и экспериментирования.
2. Сложный кариотип – много хромосом и групп сцепления.
3. Позднее половое созревание, малое число потомков в семье, медленная смена поколений.
4. Большое разнообразие экологических и социальных условий: невозможность создания одинаковых условий жизни.
Преимущества человека как генетического объекта:
1. Большое количество особей в человеческих популяциях.
2. Международное сотрудничество генетиков и обмен полученной информацией.
3. Клинически человек изучен лучше других объектов.
4. Разработка специальных методов для преодоления трудностей изучения генетики человека.
В последнее годы развитие новых методов генетики и применения их к человеку позволили устранить многие, но далеко не все трудности работы с человеком как с генетическим объектом.
Существенно облегчается генетический анализ у человека благодаря изученности его фенотипа методами морфологии, физиологии, биохимии, иммунологии, клиники. Большие перспективы в изучении наследственности и изменчивости у человека открывается в связи с использованием различных методов генетических исследований. Существует несколько методов исследования: генеалогический, близнецовый, цитогенетический, популяционно-статистический, биохимический, дерматоглифический, метод гибридизация соматических клеток и др.
3. Генеалогический метод был предложен Ф. Гальтоном в 1876 году. Генеалогический метод представляет собой изучение наследования свойств и признаков человека по родословным. Генеалогия – это учение о родословных, представляющее собой графическое изображение родственных связей между членами одной семьи в нескольких поколениях. Данный метод применим, если известны прямые родственники – предки обладателя наследственного признака (пробанда) по материнской и отцовской линиям в ряду поколений и имеется достаточное число потомков в каждом поколении, или в том случае, когда имеются данные по достаточному числу разных семей, позволяющему выявить сходство родословных. При составлении родословных используют условные обозначения предложенным Г. Юстом в 1931 году.
Рис. 1. Символы, используемые при составлении родословных.
В медицинской генетике генеалогический метод называют клинико-генеалогическим, так как он включает клиническое обследование больного и его родственников.
Он широко применяется при решении теоретических и прикладных проблем:
1. Установление наследственного характера признака.
2. Определение типа наследования заболевания и пенетрантности гена.
3. Анализ сцепления и локализации генов на хромосомах.
4. Изучение интенсивности изменения наследственного материала (частоты мутаций) у человека.
5. Расшифровка механизмов взаимодействия генов.
6. Расчет риска рождения больного ребенка при медико-генетическом консультировании.
7. Оценка прогноза заболевания.
8. Расчет риска для потомства.
Этапы генеалогического анализа:
• сбор данных о родственниках пробанда;
• построение и анализ родословной;
• выводы.
Сбор сведений о семье начинается с пробанда – лицо, с которого начинается составление родословной. Чаще всего им оказывается больной или носитель признака, сегрегацию которого необходимо проследить при анализе родословной. Всех детей одной супружеской пары называют сибсами. В родословной сибсы располагаются в порядке рождения горизонтально слева направо, начиная со старшего.
При составлении родословной желательно получить сведения о максимальном количестве родственников 3-4 поколений. Все члены одного поколения располагаются строго в одном ряду. Ряды поколений обозначают римскими цифрами. Представители одного поколения нумеруются арабскими цифрами, последовательно – слева направо.
Необходимо указывать возраст всех членов родословной, так как некоторые заболевания проявляются в различные периоды жизни, и отмечать лично обследованных знаком «!». Супруги родственников пробанда, если они здоровы, могут не изображаться.
Далее, внизу под родословной записывается легенда (о каждом члене семьи составляется краткая запись с точной характеристикой его родства с пробандом), и указывается дата составления этого документа.
После оформления изображения родословной приступают к ее анализу, целью которого является установление генетических закономерностей. При анализе родословной первой задачей является установление наследственного характера признака. Для этого используются основные принципы наследования, установленные Г. Менделем.
Следующей задачей генеалогического анализа является определение типа наследования. Для этого изучают, как заболевание распределяется среди родственников в одной семье. При анализе применяют основные принципы наследования признаков. Уточнение типа наследования заболевания по одной родословной иногда оказывается невозможным из-за малочисленности семьи, невозможности получения достоверной информации о родственниках. Анализ большого числа родословных и использование статистических расчетов обеспечивают решение этой задачи генеалогического метода. Этот метод сохраняет свое значение для определения сцепления генов и их локализации, частоты и причин изменения генетических структур, взаимодействия генов, поскольку для человеческого общества неприемлемы опыты по скрещиванию особей с разными генотипами.
В зависимости от типа наследования общая картина родословной выглядит по-разному.
Особенности родословных при аутосомно-доминантном наследовании.
1) при достаточном числе потомков признак обнаруживается в каждом поколении;
2) редкий признак наследуется примерно половиной детей;
3) потомки мужского и женского пола наследуют признак одинаково часто;
4) оба родителя в равной мере передают признак детям.
Например, по аутосомно-доминантному типу наследуется полидактилия (шестипалость), брахидактилия (короткопалость), ахондроплазия (карликовость), синдром Марфана и др.
Особенностью аутосомно-доминантного наследования при неполном доминировании и кодоминировании служит менее выраженное развитие признака у потомков – гетерозигот по сравнению с доминантными гомозиготами. Так, изменения скелета у лиц с доминантным аллелем брахидактилии (короткопалость) более выражены у гомозигот, чем у гетерозигот.
Особенности родословных при аутосомно-рецессивном наследовании.
При аутосомно-рецессивном типе наследования мутантный ген проявляет свое действие только в гомозиготном состоянии. Гетерозиготные родители больных в большинстве случаев фенотипически здоровы, но часто состоят в родственном браке. Статистический анализ большого числа родословных с аутосомно-рецессивным типом наследования позволяет установить, что больными являются примерно четверть всех потомков гетерозиготных родителей. При этом одинаково часто заболевают и мужчины, и женщины. Остальные 75% детей в этих семьях обычно здоровы. Типичные черты этого варианта, выявляемые путем анализа родословных, сводятся к следующему:
1) даже при достаточном числе потомков признак может отсутствовать в поколении детей, но появляется в поколении внуков;
2) признак может развиться у детей при отсутствии его у обоих родителей; среди детей, рождаемых в таких семьях, признак обнаруживается в 25% случаев;
3) признак наследуется всеми детьми, если оба родителя имеют его;
4) признак развивается у 50% детей, если он обнаруживается у одного супруга;
5) признак наследуется потомками мужского и женского пола одинаково часто.
Болезнями с аутосомно-рецессивным типом наследования являются фенилкетонурия, муковисцидоз, галактоземия, мукополисахариды, гепатолентикулярная дегенерация (болезнь Уилсона - Коновалова), адрогенитальный синдром, альбинизм и др.
В браке пораженного индивида и гетерозиготного носителя того же мутантного аллеля риск для будущих семей составит 50% как при аутосомно-доминантном типе наследования, так и при аутосомно-рецессивном наследовании. Поэтому этот вариант аутосомно-рецессивного наследования называется псевдодоминированием.
При наследовании признаков, сцепленных с полом, мутантный ген расположен в X- или Y-хромосоме. У женщин имеются две X-половые хромосомы, а у мужчин одна X- и одна Y-хромосома. Гены, расположенные в хромосоме Х, могут быть рецессивными или доминантными. Когда у женщин мутантный ген расположен в одной Х-хромосоме, она гетерозиготна, и гомозиготна, когда он расположен в обеих Х-хромосомах. Мужчины являются гомозиготными, потому что имеют одну хромосому Х и передают ее только дочерям. Доминантный или рецессивный ген, локализованный в его Х-хромосоме, обязательно будет проявляться.
При Х-сцепленном доминантном типе наследования отмечаются следующие особенности:
1) поражаются как мужчины, так и женщины, но больных женщин в 2 раза больше, чем больных мужчин;
2) от больного отца заболевание передается всем дочерям, а все сыновья здоровы, так как они наследуют от отца только Y-хромосому. Однако все дочери окажутся гетерозиготными носителями аномального гена;
3) признак прослеживается в каждом поколении;
4) больные женщины передают патологический аллель в 50% случаев детям независимо от пола. В случае брака такой женщины и здорового мужчины 50% их сыновей окажутся больными. Другие дети этих родителей будут здоровы, но половина дочерей станут носителями аномального гена;
5) больными дети будут тогда, когда болен один из родителей;
6) заболевание у женщины может возникнуть, если болен отец, а мать гетерозиготна.
По Х-сцепленно доминантному типу наследуются фосфатемия (недостаток фосфата в крови), коричневая эмаль зубов, рахит (не поддающийся лечению витамином D) и др.
При Х-сцепленном рецессивном типе наследования отмечаются следующие особенности:
Заболевания с Х-сцепленным рецессивным типом наследования возникают у лиц мужского пола при наличии мутантного гена в гемизиготном состоянии. Женщины являются, как правило, кондукторами (передатчиками) мутантного гена, который находится у них в гетерозиготном состоянии на одной из Х-хромосом и характеризуется следующими чертами:
1) мужчины наследует этот признак чаще, чем женщины;
2) девочки наследуют такой признак только от отца;
3) в браках, где оба супруга лишены признака, могут родиться дети, имеющие его, при этом он наследуется 50% сыновей;
4) прослеживается тенденция к чередованию поколений с большим или меньшим числом мужчин, имеющих признак.
При некоторых заболеваниях с Х-сцепленным рецессивным типом наследования у женщин носительниц можно выявить ряд биохимических, рентгенологических и других малых признаков заболевания. Например, при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна у ⅔ гетерозиготных носительниц обнаруживается в крови повышение активности фермента креатинфосфокиназы выше 150 ед/л. Если устанавливается факт гетерозиготного носительства женщиной патологического гена, риск возникновения заболевания у ее сыновей составляет 50%, такая же вероятность существует для дочерей данной женщины быть здоровыми гетерозиготными носительницами.
Характеристика Y-сцепленного (голандрического) типа наследования.
Моногенные заболевания, для которых установлен Y-сцепленный тип наследования, встречаются относительно редко. Данный тип наследования характеризуется только прямой передачей признака от отца к сыну.
В настоящее время идентифицировано около 100 генов, локализованных в Y-хромосоме. Большинство из них обусловливают развитие семенников, отвечающий за сперматогенез, контролирующий интенсивность роста тела, конечностей и зубов, определяющий оволосение ушной раковины. Мальчики, которые получили от своего отца мутацию, нарушающую развитие и функционирование мужских гонад, оказываются стерильными и не могут передатьее своему потомству, поэтому родословные оказываются неинформативными.
Близнецовый метод используется для выяснения наследственной обусловленности признаков и хорошо демонстрирует взаимоотношения между генотипом и внешней средой. В 1875 г. Ф. Гальтон предложил изучать близнецов для определения роли наследственных факторов при различиях их фенотипических особенностей. Научные основы для этих исследований были впервые разработаны Н.В.Сименсом в 1924 г.
В настоящее время близнецовый метод означает изучение генетических закономерностей на индивидах, рожденных в один день от одних родителей. Метод базируется на существовании двух типов близнецов: монозиготных и дизиготных.
Монозиготные, идентичные или однояйцовые близнецы – это дети, развивающиеся из одной оплодотворенной яйцеклетки (зиготы), которая на разных стадиях дробления делится на несколько частей. Такие особи являются генетически одинаковыми, имеют идентичный набор генов, всегда одного пола. Поэтому фенотипические различия между монозиготными близнецами вызваны факторами внешней среды.
Дизиготные, двуяйцовые или неидентичные близнецы формируются при оплодотворении нескольких яйцеклеток разными сперматозоидами. Такие особи имеют только 50% общих генов и похожи друг на друга, как обычные братья и сестры.
Близнецовый метод основывается на сравнении этих разных видов близнецов. Для исследования необходимо сначала уточнить зиготность сибсов, т.е. являются ли они моно- или дизиготными. Для этой используют анализ сходства между отдельными представителями одной родственной группы близнецов по разным внешним моногенным признакам, например, исследование рисунка ладоней, антигенов тканей, групп белков сыворотки крови и т.д.
Важным этапом при проведении исследований близнецовым методом является оценка сходства фенотипических характеристик в группах монозиготных и дизиготных близнецов. Если какой-либо признак присутствует у всех индивидов из конкретной группы близнецов, то их называют конкордантными по этому признаку. Если же близнецы отличаются по определенной фенотипической особенности, то говорят об их дискордантности. Степень конкордантности выражается в процентах (доля близнецов, совпадающих по признаку, по отношению ко всем обследованным группам близнецов).
(табл. 1).
Конкордантность близнецов для разных групп болезней (Н. П. Бочков, 2001). Табл. 1.
Заболевание Конкордантность монозиготных близнецов, % Конкордантность дизиготных близнецов, %
Болезни с наследственной предрасположенностью 40-60 4-18
Аутосомно-доминантные болезни 100 50
Аутосомно-рецессивные болезни 100 25
Конкордантность близнецов при некоторых заболеваниях
с наследственной предрасположенностью.
(Н. П. Бочков, 2001, Ф. Фогель, А. Мотульски, 1989) Табл. 2.
Заболевание
Конкордантность близнецов, %
Монозиготных Дизиготных
Косолапость 29,9 2,3
Врожденный вывих бедра 41, 4 2,8
Расщелена губы и неба 29,6 4,7
Псориаз 61 13
Желчно-каменная болезнь 26,6 6,5
Туберкулез 51,6 22,2
Ишемическая болезнь сердца 67 43
Сахарный диабет 42 12
Шизофрения 67 18
Близнецовый метод применяется для изучения многих широко распространенных заболеваний (сердечно-сосудистых, желудочно-кишечных, психических, злокачественных опухолей и т.д.). Как показано в табл.2, при этих заболеваниях конкордантность монозиготных близнецов была значительно выше, чем у дизиготных. Подобные результаты подтверждают, что возникновение полигенных болезней с наследственной предрасположенностью зависит от действия как наследственных факторов, так и внешней среды.
Для определения доли наследственной обусловленности признака рассчитывается коэффициент наследуемости (Н) по формуле Хольцингера:
Н=
Если Н ≥ 0,7 (70%), то решающая роль в проявлении признака принадлежит наследственным факторам, если показатель Н находится в интервале 0,3-0,7 (30-70%), то на проявление признака оказывают влияние как наследственные, так и внешнесредовые факторы с тем или иным преимуществом. Основная роль факторов внешней среды в проявлении признака предполагается, если Н ≤ 0,3 (30%).
Цитогенетический метод – микроскопическое изучение хромосом человека. Наиболее часто при цитогенетических исследованиях используют культуру клеток периферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов. Цитогенетические исследования стали проводиться с начала 20-х гг. ХХ в. с целью изучения морфологии и подсчета хромосом человека, культивирования лейкоцитов для получения метафазных пластинок.
Развитие современной цитогенетики человека связано с именами цитологов Д. Тио и А. Левана. В 1956 г. они первыми установили, что у человека 46 (а не 48, как думали раньше) хромосом, положили начало широкому изучению митотических и мейотических хромосом человека.
В 1959 г. французские ученые Д. Лежен, Р.Тюрпен и М.Готье установили хромосомную природу болезни Дауна. В последующие годы были описаны многие другие хромосомные болезни, часто встречающиеся у человека. Цитогенетика стала важнейшим разделом практической медицины. В настоящее время цитогенетический метод применяется для диагностики хромосомных болезней, составления генетических карт хромосом, изучения мутационного процесса и других проблем генетики человека.
Для исследования кариотипа человека достаточно получить образец периферической крови в количестве 1-2 мл. Цитогенетический анализ включает три основных этапа: 1) культивирование клеток; 2) окраску препарата; 3) микроскопический анализ препарата. Культивирование клеток проводится следующим образом. После забора образец крови помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений – фитогемаглютинина, стимулирующего процесс деления клеток. Успех цитогенетического исследования в значительной мере определяется тем, сколько клеток в культуре будут находиться в стадии метафазы. Для увеличения количества метафазных клеток за полтора часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин, который разрушает клеточное веретено, приостанавливает деление клеток на стадии метафазы и увеличивает конденсацию хромосом. Обычно, продолжительность культивирования составляет 72 ч. После его окончания клетки с питательной средой центрифугируют и помещают в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. Гипотоническая обработка приводит к разрыву ядерной оболочки и межхромосомных связей и свободному перемещению хромосом в цитоплазме. После этого производится фиксация клеток смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, после чего клеточную суспензию раскапывают на охлажденные влажные предметные стекла и высушивают на воздухе.
На следующем этапе цитогенетического исследования производится окраска препаратов. В зависимости от целей исследования, то есть от того, какой именно тип перестроек необходимо выявить, можно использовать различные виды окрашивания.
Наиболее простой метод окрашивания хромосом, называемый в настоящее время сплошным или рутинным, применяют для определения количества хромосом в препарате и выявления геномных мутаций и анеуплоидий. При этой окраске используют краситель Гимзы, который равномерно прокрашивает хромосомы по всей длине, что дает возможность идентифицировать хромосомы и оценить их количество в препарате. Этот метод окраски успешно применялся до 70-х годов прошлого века и позволил выявить этиологию большинства хромосомных синдромов, характеризующихся изменением количества хромосом. В настоящее время сплошное окрашивание применяют, в основном, для выявления количественных аномалий кариотипа, а также специфического сайта ломкости при синдроме фрагильной Х-хромосомы.
Рис. 2. Рутинная окраска препарата метафазных хромосом мужчин.
Однако использование рутинного метода окраски не позволяет выявлять структурные перестройки хромосом. В этих случаях применяют специальные методы, так называемой, дифференциальной окраски, в результате которой хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и толщина темных и светлых полос строго индивидуальны для каждой хромосомы, что позволяет проводить их точную идентификацию и выявлять структурные перестройки. Для объяснения возникновения различно окрашенных полос на хромосомах выдвигается несколько гипотез: различия в количественном содержании А-Т и G-Ц пар оснований, особенности строения нуклеосом, а также асинхронность репликации различных участков ДНК.
Наибольшее распространение получил простой и эффективный G-метод дифференциального окрашивания. В этом случае для окрашивания хромосом также используют краситель Гимзы, однако, хромосомы предварительно обрабатывают раствором трипсина. Процедура окрашивания занимает от 5 до 10 минут и приводит к появлению специфичного для каждой хромосомы рисунка поперечной исчерченности. Показано, что количество полос в метафазных и прометафазных пластинках существенно различается: в метафазных пластинках их число достигает 400, а в прометафазных – от 800 до 1000.
Рис.3. Хромосомы человека, окрашенных по G-методу.
Другие методы окраски используются реже вследствие их сложности или узкой специфичности. R – метод обусловливает сегментацию хромосом, противоположную той, которая имеет место при окраскиG – методом.
С – метод дифференциальной окраски позволяет анализировать лишь некоторые районы хромосом – участка так называемого конститутивного гетерохроматина, локализованного в околоцентромерных областях длинных плеч хромосом 1, 9 и 16, в длинном плече Y-хромосомы, а также в коротких плечах акроцентрических хромосом.
Для дифференциальной окраски хромосом могут использоваться флуорохромы: акрихин, акрихин-иприт, квинакрин и другие (Q-метод окраски). По результатам дифференциальной флуоресцентной окраски идентифицируют каждую пару гомологов, а по свечению Y-хроматина определяют наличие Y-хромосомы в интерфазном ядре.
Третий этап исследования кариотипа человека заключается в световом микроскопировании фиксированных и окрашенных препаратов метафазных хромосом.
Популяционно-статистические метод используется в генетике человека для установления частот генов и генотипов в популяции, демонстрирующие характер их изменения под влиянием окружающей среды и различных факторов популяционной динамики.
С помощью этих методов можно:
• определить частоты генов, степень гетерозиготности и полиморфизма,
• установить, как меняются частоты генов под действием отбора,
• выявить влияние факторов популяционной динамики на частоты тех или иных генотипов и фенотипов,
• проанализировать влияние факторов внешней среды на экспрессию генов,
• определить степень межпопуляционного генетического разнообразия и вычислить генетическое расстояние между популяциями.