Все про CRISPR/Cas

На сегодняшний день одной из самых обсуждаемых тем в околонаучном сообществе является система CRISPR/Cas. С помощью сервиса Google Тренды можно оценить масштаб: с 2013 года общее количество запросов по CRISPR неуклонно растет, в новостях информация активно начала появляться в 2015 году, и к настоящему времени количество запросов о криспах даже обогнало «опухоль» и «путешествия». Интерес к этой теме больше связан с практической значимостью механизма работы CRISPR/Cas систем, так как благодаря ему появилась надежда на разработку эффективного метода редактирования генома чего и кого угодно от сельскохозяйственных растений до раковых опухолей. Однако разработка этой технологии стала возможна благодаря колоссальному значению механизма работы CRISPR/Cas системы бактерий для фундаментального понимания того, как устроен биологический мир, что вызвало огромное количество исследований по этой теме и позволило достаточно быстро и глубоко выявить особенности и удивительные подробности этого механизма.
Коротко говоря, CRISPR/Cas система является защитной системой от попадания в клетку бактерии чужеродной вредной ДНК. Она состоит CRISPR кассеты, где короткие последовательности нуклеотидов организованы специальным образом и являются как бы картотекой чужеродной ДНК, с которой клетка или ее предки уже сталкивались и которую лучше уничтожить при попадании внутрь клетки. Обслуживают эту систему специальные Cas белки с широким набором функций, необходимым для обеспечения узнавания чужеродной ДНК при сверке с «картотекой» и ее быстрого и направленного разрушения, а также внесения дополнительных последовательностей в картотеку на будущее, для более точного «наведения». Сейчас все это без молекулярных подробностей звучит довольно складно и просто, однако еще 25 лет назад никто и представить себе не мог такого механизма, который, казалось бы, работает, противореча основной парадигме генетической науки.
Рассказ о функции CRISPR/Cas системы, механизм которой привел к изменению парадигмы фундаментальной биологии и генетики, установившейся в 30х годах 20го века, лучше всего начинать с истории открытия, и начинать издалека. В 19 веке было предложено две основные теории эволюции. Фундаментальное отличие их заключалось в следующем: Ламарк предполагал, что сохраняющиеся у потомства изменения (в современных терминах – мутации) появляются при взаимодействии с фактором, требующим адаптации, которая и происходит за счет такого изменения. Дарвин же утверждал, что такие мутации предсуществуют в популяции у каких-то особей, но пока фактор не воздействует, они никак не проявляются, по ним не идет отбор. Как только появляется фактор, воздействие которого дает преимущества (или наоборот) ранее нейтральной, а потому незамеченной мутации – мутация начинает проявлять себя. В начале 20 века обе теории были совершенно равнозначные в смысле количества объективных аргументов за или против одной из них. Экспериментальным путем разрешить эволюционный вопрос без молекулярных инструментов задача непростая. В первую очередь это задача выбора модельного организма, который можно было бы наблюдать в большом количестве поколений и особей в приемлемые для научного эксперимента сроки. Даже для плодовой мушки, основного модельного организма генетики в то время, с учетом весьма ограниченного количества признаков, по которым можно было проводить анализ, и предположения теории Дарвина о случайности мутаций эксперимент, позволяющий заметить такую мутацию и проанализировать ее наследуемость, потребовал бы невероятно большого количества особей в каждом поколении. Именно поэтому выбор пал на бактерии, а именно на E. coli. Тут следует пояснить знаменательность этого выбора. Кишечная палочка E. coli является одной из немногих бактерий, у которой CRISPR/Cas система не работает, хотя CRISPR-кассета у нее есть. Возможно, выбор другого объекта ознаменовал бы тогда победу ламаркизма, и эта теория не считалась бы наивной и нереалистичной долгое время.
В опыте по оценке устойчивости бактерий к бактериофагу оказалось, что распределение количества устойчивых бактерий в нескольких биологических повторах распределено не по Гауссу, как было бы в случае возникновения защитной мутации в результате столкновения с фагом в соответствии с теорией Ламарка, а по другому закону. Для обработки результатов понадобилось разрабатывать специальный математический аппарат, что было сделано физиком Дельбрюком, просто интересовавшимся биологией. В результате Дельбрюк и бактериолог Лурия получили не только доказательство того, что количество устойчивых клеток в определенном поколении зависит от того, в каком именно поколении возникла мутация, в соответствии с основами теории Дарвина, но и вывели закон Лурии-Дельбрюка. Так в 1943 году доказали общую верность теории Дарвина, тогда уже немного доработанную, а позже эти результаты были подтверждены с помощью другого метода. С этого момента эволюционная теория Ламарка оказалась на пыльной полке вместе с другими несостоявшимися теориями в истории науки.
Теперь следует вернуться непосредственно к CRISPR/Cas системам. Впервые последовательности, которые позже назовут CRISPR, были обнаружено довольно давно – 1987 году. Анекдотичным можно назвать то, что впервые CRISPR-повторы были обнаружены опять же в E. coli, у которой соответствующая система не работает. В то время не смогли разобраться к чему они относятся и какова их функция: удивились чуднОму строению (одинаковые повторы разделены вставками совсем неповторяющихся коротких последовательностей ни на что не похожих), обнаружили их высокую вариабельность между видами и внутри видов – между штаммами, и стали использовать для классификации бактерий и других микроорганизмов.
Тем не менее, загадочные повторы с неизвестной функцией не давали ученым покоя, и к 2006 году накопилось достаточно данных для того, чтобы провести первую классификацию самих CRISPR-повторов (Jansen et al 2002), обнаружить cas-гены (Makarova et al, 2006), тесно связанные с повторами, и выявить связь этой системы с защитой клетки от проникновения чужеродной ДНК (Bolotin et al 2005, Mojica et al 2005, Pourcel et al 2005).
Разгадка же функции пришла из совершенно неожиданного источника. Как упоминалось выше, уже в 90х годах знания о CRISPR-кассетах использовали для точной классификации бактерий. В медицине широко применяли методы идентификации по последовательностям CRISPR штаммов бактерий туберкулеза, что позволяло подбирать более эффективные лекарства. В промышленности же только одна фирма обратила внимание на открытие высокой вариабельности CRISPR. Фирма DANISCO занималась изготовлением штаммов для производства молочной продукции, то есть предоставляла фермерам и различным фабрикам бактерии, которые следовало поместить в закваску для получения определенного вида сыра или другого кисломолочного продукта. В зависимости от вида бактерий получался продукт с разными вкусовыми свойствами. Во всем этом существовало одно значительное затруднение – штаммы одного вида могут значительно отличаться по устойчивости к разным фагам, а заражение бактерий закваски приводит к нарушению технологии и тому, что весь производственный чан с закваской и субстратом портится. Решения может быть два: либо создать штамм, устойчивый к максимально возможному количеству фагов, либо анализировать каждое производство и отправлять туда такие штаммы, которые устойчивы именно к тому набору фагов, что встречаются на отдельном производстве. Изучая последовательности кассет различных промышленных штаммов бактерии Streptococcus thermophiles, с помощью которых получают всевозможные кисломолочные продукты, поняли, что эти последовательности можно использовать для высокоточной идентификации штаммов и подбирать такие, которые будут эффективны в условиях конкретного производства. Интересно, что такой подход оказался удобен не только непосредственно на производстве, но и для патентования новых разработанных штаммов.
Однако идея понять, от чего зависит устойчивость к бактериофагам и как она связана с CRISPR-кассетами, не давала покоя научным сотрудникам фирмы DANISCO Рудольфу Барангу и Филиппу Ховарту. Они отбирали мутации устойчивости к фагу у разных штаммов Streptococcus thermophiles. Им нужно было найти такие бактерии, которые были бы устойчивы к фагам, но при этом производили все тот же определенный тип сыра. Для этого они проводили довольно простой опыт: смотрели устойчивость разных штаммов к фагам, обнаруженным на проблемных молокозаводах или сыроварнях. В результате оказалось, что устойчивость Streptococcus thermophiles работает по совсем другому механизму, чем у E. coli. В то время было известно, что бактерии могут избежать заражения фагом, изменяя рецепторы на поверхности клетки, из-за чего фаг просто не может с ней связать, чтобы проникнуть внутрь. Однако по результатам экспериментов фаги нормально связывались с устойчивыми клетками Streptococcus thermophiles, но клетки все равно выживали и вирусного потомства не наблюдалось. Тогда они сравнили последовательности CRISPR-кассет выживших клеток с изначальными. У устойчивых клеток обнаружили новый участок в кассете. Чтобы подтвердить свою догадку, они биоинженерными способами создали штамм, который отличался от неустойчивого к заражению фагом только добавленным искусственно участком, гомологичным фрагменту соответствующего бактериофага, в CRISPR-кассете. Такие модифицированные бактерии оказались устойчивы к именно этому фагу (Horvath, 2010).
Таким образом, оказалось, что механизм действия CRISPR/Cas системы работает по принципу изменения последовательности ДНК в ответ на воздействие внешней среды, то есть то, что происходит во взрослой жизни клетки, запоминается в ДНК и передается ее потомству, а это в свою очередь является основой эволюционной теории Ламарка и нарушает один из главных принципов генетики о том, что изменение ДНК может происходить случайным образом вследствие ошибок или воздействия токсинов, но не направленно. Именно этот факт возбудил такой большой интерес к теме CRISPR – никому не верилось до конца, что такое возможно. С одной стороны, были попытки опровергнуть выдвинутую гипотезу о механизме CRISPR, с другой стороны, было невероятно интересно и важно понять, как это работает. Все это привело к подробнейшему и активному изучению систем CRISPR/Cas, что, в свою очередь, позволило обнаружить белок Cas9, о котором в основном все и говорят, так как с его помощью возможно сравнительно простое и эффективное редактирование генома (хотя в научных исследованиях этот вопрос еще не разрешён).
Интересно, что это открытие принципа работы CRISPR кассет помогает узнать еще и кое-что об эволюции биологического мира, причем не только мира бактерий. Дело в том, что новые последовательности всегда встраиваются в кассету с одной и той же стороны, что приводит к формированию кассеты как некоей линии времени – от самой старой последовательности к самой новой. Это дает возможность узнать о жизни довольно древних представителей огромной группы живых существ, от которой не осталось, да и не могло остаться палеонтологических свидетельств. Также, это позволяет изучать различные изменения древних животных, исследуя последовательность CRISPR-кассет бактерий в их пищеварительной системе.
1. Jansen R., Embden J.D., Gaastra W. et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in procaryotes, Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002)
2. Makarova K.S., Grishin N.V., Shabalina S.A., et al. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct. 1, 7, 2006.
3. Bolotin A., Quinguis B., Sorokin A., Ehrlich S.D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPR) have spacers of extrachromosomal origin, Microbiology. 151, 2551-2561 (2005).
4. Mojica F.J., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J. et al. Intervening sequences of regularly spaced procaryotic repeats derive from foreign geneticc elements. J Mol Evol. 60, 174-182 (2005).
5. Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology. 151, 653-663 (2005).
6. Horvath, Rodolphe, 2010
(Автор: Светлана Жикривецкая)