Николай Иванович родился в Москве в 1810 году, в семье военного казначея, майора Ивана Ивановича Пирогова (1772—1826). Мать Елизавета Ивановна Новикова принадлежала к старой московской купеческой семье. Четырнадцатилетним мальчиком поступил на медицинский факультет Московского университета. Получив диплом, ещё несколько лет учился за границей. К профессорской деятельности Пирогов готовился в Профессорском институте при Дерптском университете. Здесь, в хирургической клинике, Пирогов проработал пять лет, блестяще защитил докторскую диссертацию и в возрасте всего лишь двадцати шести лет был избран профессором Дерптского университета

Через несколько лет Пирогов был приглашён в Петербург, где возглавил кафедру хирургии в Медико-хирургической Академии. Одновременно Пирогов руководил организованной им Клиникой госпитальной хирургии. Поскольку в обязанности Пирогова входило обучение военных хирургов, он занялся изучением распространённых в те времена хирургических методов. Многие из них были им в корне переработаны; кроме того, Пирогов разработал ряд совершенно новых приёмов, благодаря чему ему удавалось чаще, чем другим хирургам, избегать ампутации конечностей. Один из таких приёмов до настоящего времени называется «Операция Пирогова»

В поисках действенного метода обучения, Пирогов решил применить анатомические исследования на замороженных трупах. Сам Пирогов это называл «ледяной анатомией». Так родилась новая медицинская дисциплина — топографическая анатомия. Спустя несколько лет такого изучения анатомии, Пирогов издал первый анатомический атлас под заглавием «Топографическая анатомия, иллюстрированная разрезами, проведёнными через замороженное тело человека в трёх направлениях», ставший незаменимым руководством для врачей-хирургов. С этого момента хирурги получили возможность оперировать, нанося минимальные травмы больному. Этот атлас и предложенная Пироговым методика стали основой всего последующего развития оперативной хирургии.

В 1847 году Пирогов уехал на Кавказ в действующую армию, так как хотел проверить в полевых условиях разработанные им операционные методы. На Кавказе он впервые применил перевязку бинтами, пропитанными крахмалом. Крахмальная перевязка оказалась удобнее и прочнее, чем применявшиеся раньше лубки. Здесь же, в ауле Салта, Пирогов впервые в истории медицины начал оперировать раненых с эфирным обезболиванием в полевых условиях. Всего великий хирург провёл около 10 тыс. операций под эфирным наркозом. В 1855 году, в бытность свою старшим учителем Симферопольской гимназии, Д. И. Менделеев, с юности испытывавший проблемы со здоровьем (подозревали даже, что у него чахотка), по просьбе петербургского врача Н. Ф. Здекауэра был принят и осмотрен Н. И. Пироговым, который, констатируя удовлетворительное состояние пациента, заявил: «Вы нас обоих переживёте» — предначертание это не только вселило в будущего великого учёного уверенность в благосклонности к нему судьбы, но и сбылось.

В 1855 году, во время Крымской войны, Пирогов был главным хирургом осаждённого англо-французскими войсками Севастополя. Оперируя раненых, Пирогов впервые в истории русской медицины применил гипсовую повязку, дав начало сберегательной тактике лечения ранений конечностей и избавив многих солдат и офицеров от ампутации. Во время осады Севастополя, для ухода за ранеными, Пирогов руководил обучением и работой сестёр Крестовоздвиженской общины сестёр милосердия. Это тоже было нововведением по тем временам. Важнейшей заслугой Пирогова является внедрение в Севастополе совершенно нового метода ухода за ранеными. Метод этот заключается в том, что раненые подлежали тщательному отбору уже на первом перевязочном пункте; в зависимости от тяжести ранений одни из них подлежали немедленной операции в полевых условиях, тогда как другие, с более лёгкими ранениями, эвакуировались вглубь страны для лечения в стационарных военных госпиталях. Поэтому Пирогов по справедливости считается основоположником специального направления в хирургии, известного как военно-полевая хирургия.

Пирогов обучил и руководил работой бригады медсестёр, направленных в Крым по почину великой княгини Елены Павловны. Ассистировал ему в Севастополе известный в будущем врач Эраст Каде. За заслуги в оказании помощи раненым и больным Пирогов был награждён орденом Святого Станислава 1-й степени, дававшим право потомственного дворянства. Несмотря на героическую оборону, Севастополь был взят осаждающими, и Крымская война была проиграна Россией. Вернувшись в Петербург, Пирогов на приёме у Александра II рассказал императору о проблемах в войсках, а также об общей отсталости русской армии и её вооружения. Император не захотел прислушаться к Пирогову. С этого момента Николай Иванович впал в немилость, он был направлен в Одессу на должность попечителя Одесского и Киевского учебных округов. Пирогов попытался реформировать сложившуюся систему школьного образования, его действия привели к конфликту с властями, и учёному пришлось оставить свой пост. Его не только не назначили министром народного просвещения, но и отказались даже сделать его товарищем (заместителем) министра, вместо этого его «сослали» руководить обучающимися за границей русскими кандидатами в профессора. Он выбрал своей резиденцией Гейдельберг, куда прибыл в мае 1862.

Глава русского землячества Гейдельберга, провёл сбор средств на лечение Гарибальди и уговорил Пирогова осмотреть раненого Гарибальди. От денег Пирогов отказался, но к Гарибальди поехал и обнаружил не замеченную другими всемирно известными врачами пулю, настаивал, чтобы Гарибальди покинул вредный для его раны климат, в результате чего итальянское правительство освободило Гарибальди из плена. По всеобщему мнению, именно Н. И. Пирогов тогда спас ногу, а, скорее всего, и жизнь осуждённому другими врачами Гарибальди. В своих «Мемуарах» Гарибальди вспоминает: «Выдающиеся профессора Петридж, Нелатон и Пирогов, проявившие ко мне великодушное внимание, когда я был в опасном состоянии, доказали, что для добрых дел, для подлинной науки нет границ в семье человечества…».После этого случая, вызвавшего фурор в Петербурге, произошли покушение на Александра II нигилистами, восхищавшимися Гарибальди, и, главное, участие Гарибальди в войне Пруссии и Италии против Австрии, что вызвало неудовольствие австрийского правительства, и «красный» Пирогов был вообще уволен с государственной службы даже без права на пенсию.

В расцвете творческих сил Пирогов уединился в своём небольшом имении «Вишня» неподалёку от Винницы, где организовал бесплатную больницу. Он ненадолго выезжал оттуда только за границу, а также по приглашению Петербургского университета для чтения лекций. К этому времени Пирогов уже был членом нескольких иностранных академий. Относительно надолго Пирогов лишь дважды покидал имение: первый раз в 1870 году во время франко-прусской войны, будучи приглашён на фронт от имени Международного Красного Креста, и второй раз, в 1877—1878 годах — уже в очень пожилом возрасте — несколько месяцев работал на фронте во время русско-турецкой войны.

Когда император Александр II посетил Болгарию в августе 1877 года, во время русско-турецкой войны, он вспомнил о Пирогове как о несравненном хирурге и лучшем организаторе медицинской службы на фронте. Несмотря на свой пожилой возраст (тогда Пирогову исполнились уже 67 лет), Николай Иванович согласился отправиться в Болгарию при условии, что ему будет предоставлена полная свобода действий. Его желание было удовлетворено, и 10 октября 1877 года Пирогов прибыл в Болгарию, в деревню Горна-Студена, недалеко от Плевны, где располагалась главная квартира русского командования.

В 1881 году Н. И. Пирогов стал пятым почетным гражданином Москвы «в связи с пятидесятилетней трудовой деятельностью на поприще просвещения, науки и гражданственности». Также был избран членом-корреспондентом Санкт-Петербургской академии наук. В начале 1881 года Пирогов обратил внимание на боль и раздражение на слизистой твердого неба, 24 мая 1881 года Н. В. Склифосовский установил наличие рака верхней челюсти. Умер Н. И. Пирогов в 20 ч 25 мин 23 ноября 1881 года.[5] в с. Вишня, ныне часть Винницы. Тело Пирогова было забальзамировано его лечащим врачом Д. И. Выводцевым с использованием только что разработанного им метода, и погребено в мавзолее в деревне Вишня под Винницей. В конце 1920-х годов в склепе побывали грабители, которые повредили крышку саркофага, выкрали шпагу Пирогова (подарок Франца Иосифа) и нательный крест. Во время Второй мировой войны, при отступлении советских войск, саркофаг с телом Пирогова был скрыт в земле, при этом повреждён, что привело к порче тела, впоследствии подвергнутого реставрации и повторному бальзамированию. Официально гробница Пирогова именуется «церковь-некрополь», тело находится немного ниже уровня земли в крипте — цокольном этаже православного храма, в застекленном саркофаге, к которому возможен доступ желающих отдать дань уважения памяти великого ученого.