Дастин Ли Хоффман родился 8 августа 1937 года в Лос-Анджелесе.

Его родственники со стороны матери приехали в США из Румынии, а со стороны отца — из Российской империи. Оба были евреями, но традиций не придерживались.
В школе Дастин, по его словам, был «паршивой овцой»: маленький, стеснительный и не очень успешный в учебе. В семье он тоже терялся на фоне успехов старшего брата — круглого отличника, которому удалось однажды сняться в массовке голливудского фильма.
Мать Хоффмана была пианисткой, он тоже собирался стать музыкантом. После школы поступил в колледж искусств, но бросил его, так как в программе актерскому мастерству уделяли больше внимания, чем специальности. Дастин поступил в консерваторию. Отучившись два года на факультете классического и джазового пианино он понял, что все-таки играть роли ему нравится больше, чем играть музыкальные пьесы.
Хоффман поступил в театральную школу Pasadena Playhouse (одной из его однокурсниц была Барбра Стрейзанд), но и там считал себя худшим. Однажды его позвали на роль адвоката в спектакле, и после нескольких представлений режиссер сказал Дастину, что он хороший артист, но его расцвет наступит к 30 годам. Хоффман решил, что столько ждать не согласен. Он переехал в Нью-Йорк и с четвертой попытки поступил в актерскую студию Ли Страсберга. Параллельно с учебой он играл на Бродвее.
В 1966 году вышел спектакль «Путешествие пятой лошади». Хоффман, недавно получивший диплом, играл в нем заметную роль. Постановку критики разгромили, но игру Хоффмана отметили. За эту работу он получил первую театральную премию. Следующий спектакль с его участием, комедия «Э?», стал хитом и принес еще одну премию. Тогда же актер дебютировал в кино, но это были эпизоды.
Первую главную роль в кино Хоффман сыграл в фильме «Выпускник». По задумке авторов персонаж должен был быть высоким спортивным блондином. Но режиссер Майк Николс увидел Хоффмана в театре и понял, что ему нужен именно этот маленький брюнет, который на десять лет старше героя (Бенджамину через неделю должен исполниться 21 год, Дастину было 30).
Фильм получил множество наград, в том числе BAFTA, «Золотой глобус» и номинацию на «Оскар» Хоффману.
В 1969 году вышел «Полуночный ковбой». После этого Хоффман стал востребованным артистом, и на него посыпались предложения.
В 1979 году Хоффман получил «Оскар» за «Крамер против Крамера». Сам фильм стал мегапопулярным, получил больше 50 номинаций на разные премии и до сих пор постоянно попадает в различные списки лучших.
В 1982 году вышел фильм «Тутси». Хоффман уже был признанной звездой и мог диктовать условия. Он уговорил режиссера Сидни Поллака сыграть одну из ролей (агент главного героя) и пригласить на другую роль Билла Мюррея. Картина стала хитом и до сих пор считается знаковым фильмом эпохи.
В 1987 году вышел «Иштар». Он стал провалом, но за ним последовал «Человек дождя».
В 90-х фильмы, в которых снимался Хоффман, становились коммерчески успешными, но значимых наград не приносили. Прорывом стала политическая сатира «Хвост виляет собакой» Барри Левинсона (также выходил под названием «Плутовство») (1997).
Картина принесла Хоффману еще одну номинацию на «Оскар» и несколько других премий.
В 2004 году вышла комедия «Знакомство с Факерами», в которой Хоффман снимался вместе с бывшей однокурсницей Барброй Стрейзанд. Критики оценили фильм неоднозначно, но он собрал неплохую кассу. В 2010 году вышла вторая часть фильма. Хоффман не хотел сниматься, но его уговорили появиться всего в нескольких сценах. Этот фильм провалился.
Сейчас Хоффман продолжает работать. Фильм Питера Гринуэя «Смертельная Лукка» еще не вышел. Сюжет держат в секрете, но известно, что он связан с терактом 11 сентября 2001 года и поездкой героя в итальянский город Лукка.
Дастин Хоффман был женат на балерине Энн Бьорн с 1969 по 1980 годы. У них есть общая дочь Дженна, также Хоффман удочерил старшую дочь жены, Карину. Хоффман продолжил общение с детьми, потому что, по его словам, ему было важно остаться в их жизни.
Через неделю после развода он женился на адвокате Лайзе Готтсеген. Брак продолжается до сих пор, у них четверо детей: сыновья Джейк и Максвелл и дочери Ребекка и Александра.
Все дети Хоффмана в детстве снимались вместе с ним, но свою жизнь с кино связали только Джейк и Максвелл.