ЗАНЯТИЕ № 9

Генная инженерия
Генетическая инжене́рия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.
Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.
Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
• специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
• быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
• конструирование рекомбинантной ДНК;
• гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;
• клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
• введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
Во второй половине XX столетия биология вступила в свой «Золотой век». Достижения молекулярной биологии, биохимии и генетики дали начало новому разделу науки – генной инженерии и биотехнологии.
Цель генной инженерии - конструирование генетических структур по зарание намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой, путем переноса генетической информации из одного организма в другой.
Генетическая инженерия создает задели на пути познания способов и путей «конструирования» новых или улучшения существующих организмов, придавая им большую хозяйственную ценность и способность резкого увеличения продуктивности биотехнологических процессов. Генетическая инженерия и биотехнология стимулировали разработку методов бионанотехнологиии.
В рамках генетической инженерии различают генную и клеточную инженерию. Под генной инженерией понимают манипуляции с целью создания рекомбинантных молекул ДНК. Часто эту методологию называют молекулярным клонированием, клонированием генов, технологией рекомбинантных ДНК или просто генетическими манипуляциями. Важно подчеркнуть, что объектом генной инженерии являются молекулы ДНК, отдельные гены. Напротив, под клеточной инженерией понимают генетические манипуляции с изолированными отдельными клетками или группами клеток растений и животных.
Главные вехи в развитии генной инженерии представлены в табл. 1.
1970 г. – Келли и Смит выделили рестриктазу.
1972 г. – П. Берг получил invitro рекомбинантную ДНК.
1978 г. – создан генно-инженерный инсулин и гормон роста человека.
1986 г. – создан вакцина против гепатита В и интерферон.
1987 г. – первые полевые испытания генетически модифицированных с/х растений (томат, устойчивый к вирусным заболеваниями).
1990 г. – начало международного проекта «Геном человека».
1990 г. – впервые успешно проведена генная терапия четырехлетней девочки с нарушением иммунитета.
1993 г. – начато продажа продуктов питания, содержащих генетически модифицированные организмы.
1997 г. – Я. Уилмут и К. Кэмпбелл – «овечка Долли».
1997 г. – клонированы овцы, которые несли человеческий ген «антигемофильного фактора IX».
1998 г. – выращиваются эмбриональные стволовые клетки.
1998 г. – впервые создана полная генетическая карта животного (Caenorhabditiselegans).
2001 г. – создана первая полная генетическая карта риса.
2003 г. – завершение проекта «Геном человека».
2003 г. – проект «Encode».
2007 г. – завершение первого этапа проекта «Encode».
Первым этапом методов генной инженерии является получение наследственного материала. Небольшие гены прокариот можно синтезировать химическим путем, если полностью известна последовательность нуклеотидов. Так впервые в 1970 году Г. Корана синтезировал ген аланиновой т-РНК. Синтез сложных генов проводят с помощью обратной транскрипции методом ферментативного синтеза. В качестве матрицы используют выделенную и-РНК. С помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) на ней синтезируют кодирующую нить ДНК, которую затем реплицируют (для получения второй, комплементарной нити ДНК). Полученные таким способом гены не функционируют в клетках, так как не имеют промотора и регуляторной части. При переносе в бактерию к структурным генам присоединяют промотор оперона, и транскриптон начинают работать.
Необходимые для пересадки гены можно получать с помощью рестриктаз. Рестриктазы – ферменты, открытые в 1964 году. К настоящему времени их выделено более 500. Они могут узнавать определенные последовательности нуклеотидов вырезать эти участки из цепи ДНК. На концах фрагмента ДНК образуются одноцепочечные «липкие концы».
Полученные гены соединяют с векторными молекулами, которыми могут быть плазмиды бактерий, вирусы и фаги. Рестриктаза разрывает кольцевую ДНК плазмиды, в нее вводят ген (участок ДНК). Фермент лигаза соединяет липкие концы плазмиды с липкими концами гена и получается молекула рекомбинантной ДНК. Такая ДНК способна проникать в клетку – реципиент.
Рекомбинантные молекулы ДНК попадают не во все клетки. Поэтому на специальных питательных средах проводят отбор трансформированных клеток с введенным в них геном. Далее проводят размножение клеток с рекомбинантной ДНК и получают клон клеток с определенными свойствами.
В основе генной инженерии лежит целенаправленное манипулирование с фрагментами нуклеиновых кислот. Генная инженерия успешно развивается с 1970 года.
Этапы методов генной инженерии:
1. Получение генетического материала.
2. Анализ фрагментовДНК.
3. Конструирование векторной молекулы ДНК invitro, способной реплицироваться автономно invivo.
4. Введение рекомбинантных ДНК в клетку – реципиент.
5. Селекция клонов клеток, содержащих молекулы гибридной ДНК.
Способы получения генов:
1. Матричный синтез (биоферментативный) – обратная транскрипция генов с помощью ревертазы:
• и-РНК используется как матрица для синтеза цепи ДНК.
• цепь ДНК реплицируют при помощи ДНК-полимеразы.
2. Химико – ферментативный синтез invitro:
• можно синтезировать короткие гены с известной последовательностью (секвенированние).
• для секвенирования генов используют методы:
→Максама–Гилберта (1977).
→Сэнгера (1975).
Метод Максама – Гилберта основан на химической деградации ДНК.
• ОдинизконцовсеквенируемогофрагментаДНКпомечают32Р или флюорисцирующей меткой.
• Препаратмеченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентами, специфически разрушающими одно из четырех оснований ДНК: А, Г, Т, Ц.
Метод Сэнгера основан на включении модифицированных нуклеотидов в синтезирующуюся цепь ДНК, являющихся терминаторами элонгации.
3. Получение генов с помощью рестриктаз.
Рестриктазы – это ферменты, узнающие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции) и разрезающие молекулу в этих точках. Сайты рестрикции – палиндромные последовательности, специфичные для каждого вида рестриктазы. Разрезание приводит к появлению липких или тупых концевых фрагментов ДНК.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) К. Мюллис, 1980.
Метод используется для увеличения числа выделенных или синтезированных генов: это быстрая репликация фрагментов ДНК (амплификация) invitro.
Для реакции необходимо:
• Tag – ДНК – полимераза.
• среда со свободными нуклеотидами (А, Т, Г, Ц).
• праймеры ДНК.
• амплификатор.
Стадии ПЦР:
1. Денатурация - +90ºС, 15 сек. Образуются одноцепочечные фрагменты инкубируемой ДНК.
2. Гибридизация - +50ºС, 30 сек. Гибридизация цепей ДНК спраймерами.
3. Полимеризация - +70ºС, 90 сек. Tag – ДНК – полимераза удлиняет праймеры до размеров матричных ДНК.
Использовние полученных генов.
1. Промышленное производство БАД (Биологически активные добавки).
2. Создание и производство вакцин.
3. Генодиагностика.
4. Генотерапия.
Получение БАД (Биологически активные добавки):
• Создание рекомбинантной ДНК (вектора).
• Введение векторной молекулы в клетку.
• Отбор трансформированных клеток с работающим геном.
• Производство БАД (Биологически активные добавки).
Вектор – небольшая автономно реплицирующиеся молекула ДНК, обеспечивающая функционирование встроенного в нее гена.
Требования к векторам:
• автономная репликацияв клетке.
• стабильноенаследование клеткой – хозяином.
• наличие большого числа копий в клетке.
• достаточная емкость.
• наличие «удобных» сайтов рестрикции.
• наличие селективных маркеров.
Виды векторов:
Плазмиды– небольшие кольцевые ДНК бактерий; используются для переноса генов.
Фаговые векторы – ДНК содержащие бактериофаги: фаг λ, фагМ 13.
Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу.
Фазмиды– являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды.
Челночные векторы – способны к репликации в разных клетках – хозяевах: Одни и те же гены получают возможность реплицироваться и экспрессироваться в разных организмах.
Основной вектор для клонирования генов животных – геном вируса – SV40.
Основные векторы для клонирования растений – геномы вирусов растений и плазмидаpTi агробактерий.
Стволовые клетки – это недифференцированные клетки, которые первыми образуются в организме зародыша и дифференцируют в специализированные ткани человеческого организма.
Первое предположение о существовании стволовых клеток было высказано русским ученым Александр Александрович Максимовым (1874 - 1928), выдающейся ученый, один из создателей унитарной теории кроветворения. Максимов А.А. во многим предопределил направление развития мировой науки в области клеточной биологии. Термин «стволовая клетка» Максимов А.А. предложил еще в 1908 году, чтобы объяснить механизм быстрого самообновления клеток крови. Он выступил с новой теорией кроветворения в Берлине на съезде гематологов. Именно этот год можно по праву считать началом истории развития исследований стволовых клеток!
Каждые сутки в крови погибают несколько миллиардов клеток, а им на смену приходят новые популяции эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов. Максимов А.А. первый догадался, что обновление клеток крови – это особая технология, отличная от простых клеточных делений. Если бы клетки крови самообновлялись простым клеточным делением, это потребовало бы гигантских размеров костного мозга.
Сегодня стволовые клетки – это орган экстренной репарации в случае аварийных, массивных повреждений ткани (травмы, вирусы, химические, тепловые повреждения). В долгосрочном плане стволовые клетки – это аппарат клеточного гомеостаза, основанного на постоянном самообновлении клеток, смены устаревших, отработанных клеток с целью защиты от болезней (накопления аномальных клеток) и преждевременного старения. Стволовые клетки являются исходными при образовании специализированных дифференцированных клеток. Существует иерархия стволовых клеток.
Тотипотентные – стволовые клетки могут далее давать в процессе последовательных превращений множество типов клеток организма. Такими клетками являются эмбриональные стволовые клетки (ЭСК).
Плюрипотентные – стволовые клетки характеризуются способностью давать множество разных типов дифференцированных клеток в определенном типе ткани. К таким клеткам относятся клетки костного мозга.
Унипотентные – стволовые клетки способны образовывать только один тип дифференцированных клеток. Это означает, что они могут давать только строго определенные типы конечных дифференцированных клеток. Стволовые клетки теоретически способны к неограниченному делению. При делении стволовых клеток часть из дочерних клеток остается стволовыми, другая начинает процесс дифференцировки.
Для быстрого восстановления после перенесенной травмы в пожилом возрасте, последствие инсульта и инфаркта, успешно применяются мезенхимальныеаутологичные (собственные) стволовые клетки, которые можно получить различными способами (из перефирической крови, мышечной, жировой ткани, костного мозга). Процедура занимает от 4 дней дот 19-60, в зависимости от метода и необходимости клонирования исходного материала для последующего введения и хранения.
Во взрослом организме стволовые клетки находятся, в основном, в костном мозге и, в очень небольших количествах, во всех органах и тканях. Они обеспечивают восстановление поврежденных участков органов и тканей. Стволовые клетки, получив от регулирующих систем сигналы о какой-либо «неполадке», по кровяному руслу устремляются к пораженному органу. Они восстановить практически любое повреждение, превращаясь на месте в необходимые организму клетки (костные, гладкомышечные, печеночные, сердечной мышцы или даже нервные) и стимулируя внутренние резервы организма к регенерации (восстановлению) органа и ткани.
Запас стволовых клеток взрослого организма очень невелик. Поэтому случается так, что обновить утраченные клетки организм самостоятельно уже не в состоянии: или очаг поражения слишком велик, или организм ослаблен, или возраст уже не тот. Можно ли помочь больному излечиться от цирроза, инсульта, паралича, диабета, ряда заболеваний нервной системы? Уже сегодня в ряде случаев, ученые умеют направлять стволовые клетки «по нужному пути». Достижения в этой области клеточной медицины делают возможности терапевтического использования стволовых клеток практически безграничными.
Генная инженерия оказались очень перспективной для медицины, прежде всего, в создании новых технологий получения физиологически активных белков, используемых в качестве лекарств (инсулин, соматостатин, интерфероны, соматотропин и др.).
Инсулин используют для лечения больных диабетом, который стоит на третьем месте (после болезней сердца и рака) по частоте вызываемых смертельных случаев. Мировая потребность инсулина составляет несколько десятков килограммов. Традиционно его получают из панкреатических желез свиней и коров, но гормоны этих животных слегка отличаются от инсулина человека. Инсулин свиней различается по одной аминокислоте, а коровий – по трем. Считают, что инсулин животных часто вызывает побочные эффекты. Хотя химический синтез инсулина осуществлен давно, но до сих пор промышленное производство гормонов оставалось очень дорогим. Сейчас получают дешевый инсулин с помощью генно-инженерного метода путем химико-ферментативного синтеза гена инсулина с последующим введением этого гена в кишечную палочку, которая затем синтезирует гормон. Такой инсулин более «биологичен», так как химически идентичен инсулину, вырабатываемому клетками поджелудочной железой человека.
Интерфероны – белки, синтезируемые клетками, главным образом в ответ на заражение организма вирусами. Интерфероны характеризуется видовой специфичностью. Например, у человека установлены три группы интерферонов, продуцируемых различными клетками под контролем соответствующих генов. Интерес к интерферонам определяется тем, что их широко используют в клинической практике для лечения многих болезней человека, особенно вирусных.
Имея крупные размеры, молекулы интерферона мало доступны для синтеза. Поэтому большинство интерферонов сейчас получают из крови человека, но выход при таком способе получения небольшой. Между тем потребности в интерфероне исключительно велики. Это поставило задачу изыскать эффективный метод производства интерферона в промышленных количествах. Генетическая инженерия лежит в основе современного производства «бактериального» интерферона.
Усилилось влияние генетической инженерии на технологию тех лекарственных веществ, которые уже давно создаются по биологической технологии. Еще в 40- 50-е гг. ХХ в. была создана биологическая промышленность для производства антибиотиков, которые составляют наиболее эффективную часть лекарственного арсенала современной медицины. Однако в последние годы отмечается значительный рост лекарственной устойчивости бактерий, особенно к антибиотикам. Причина заключается в широком распространении в микробном мире плазмид, детерминирующих лекарственную устойчивость бактерий. Именно поэтому многие знаменитые ранее антибиотики утратили свою былую эффективность. Единственный пока путь преодоления резистентности бактерий к антибиотикам – это поиски новых антибиотиков. По оценкам специалистов, в мире ежегодно создают около 300 новых антибиотиков. Однако большинство из них либо неэффективно, либо токсично. В практику же каждый год вводится лишь несколько антибиотиков, что заставляет не только сохранять, но и увеличивать мощность антибиотической промышленности на основе генно-инженерных разработок.
Основные задачи генной инженерии в тех технологиях лекарственных веществ, в которых продуцентами лекарств являются микроорганизмы, определяются необходимостью генно-инженерной реконструкции последних с целью повышения их активности. В то же время началась реализация идеи создания лекарств в виде малых молекул, что способствует их большей эффективности.
Значительный практический интерес представляет метод получения искусственного гемоглобина путем введения гемоглобиновых генов в растения табака, где под контролем этих генов продуцируются ά- иβ-цепиглобина, которые объединяются в гемоглобин. Синтезируемый в клетках табачных растений гемоглобин полностью функционален (связывает кислород). Клеточная инженерия в применении к человеку связана не только с решением фундаментальных проблем биологии человека, но и с преодолением, прежде всего, женского бесплодия. Поскольку частота положительных случаев имплантации в матку женщин эмбрионов, полученных invitro, является небольшой, то получение монозиготных близнецов-эмбрионов invitro также имеет значение, так как увеличиваются возможности повторных имплантаций за счет «запасных» эмбрионов. Особый интерес представляют перспективы использования стволовых клеток в качестве источника замены клеток и тканей в лечении таких болезней, как диабет, повреждения спинного мозга, боли сердца, остиоартриты, болезнь Паркинсона. Но для реализации этих перспектив необходимо углубленное изучение биологии стволовых клеток.
В использовании генетической инженерии применительно к проблемам медицины особое значение приобрела задача разработки генно-инженерных методов радикального лечения наследственных болезней, которые, к сожалению, еще не поддаются лечению существующими методами. Содержание этой задачи заключается в разработки способов исправления (нормализации) мутаций, результатом которых являются наследственные болезни, и в обеспечении передачи «исправлений» по наследству. Считают, что успешной разработке генно-инженерных методов лечения наследственных болезней будут способствовать данные о геноме человека, полученные в результате выполнения международной научной программы «Геном человека».